SeroKrystal™PDL微孔板在無血清條件下提升細(xì)胞活力、形態(tài)及增殖能力

作者： Ewa Wosiek，項目支持科學(xué)家  & Dr. Lindsay Parkes，高級項目科學(xué)家，Porvair Sciences Ltd.

關(guān)鍵詞：poly-d-lysine 聚D-賴氨酸，PDL、 krystal,、serum-free 無血清、細(xì)胞培養(yǎng)、Sero

摘要

研究人員在無血清環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，以更準(zhǔn)確地模擬生理條件。然而，在無血清條件下，許多細(xì)胞系難以附著于組織培養(yǎng)塑料表面，從而給細(xì)胞培養(yǎng)帶來挑戰(zhàn)。本應(yīng)用說明展示了 Sero Krystal™ 聚-D-賴氨酸（PDL）涂層微孔板如何克服這些問題，在無血清培養(yǎng)基中促進(jìn)細(xì)胞更好的附著、生長和增殖，特別適用于較難培養(yǎng)的細(xì)胞類型。

引言

細(xì)胞培養(yǎng)和分析技術(shù)正在快速發(fā)展，高通量篩選（HTS）的需求不斷增長，特別是在藥物篩選和發(fā)現(xiàn)等大規(guī)模應(yīng)用中。近年來，多種基于細(xì)胞的 HTS 方法被用于開發(fā)潛在的抗冠狀病毒治療方案，以篩選能夠抑制 SARS-CoV-2 復(fù)制的廣譜抗病物。在使用貼壁細(xì)胞系的實(shí)驗中，科學(xué)家通常會考慮在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充胎牛血清（FBS）等動物來源的血清，以幫助細(xì)胞附著在培養(yǎng)器皿的塑料表面。

盡管血清有助于細(xì)胞生長，但其應(yīng)用也存在諸多風(fēng)險，包括污染、環(huán)境與倫理問題、成本及供應(yīng)穩(wěn)定性等。此外，批次間差異性也是傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的一大挑戰(zhàn)。對于貼壁細(xì)胞而言，能夠牢固地附著于培養(yǎng)基質(zhì)表面是其增殖和分化的關(guān)鍵前提。Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板為此提供了理想的解決方案，無需使用動物來源血清，即可確保細(xì)胞的附著、存活及增殖能力。

圖 1. 聚賴氨酸分子結(jié)構(gòu)示意圖。賴氨酸是一種氨基酸，有兩種對映體，即 L-賴氨酸和 D-賴氨酸

賴氨酸是一種氨基酸，存在兩種對映異構(gòu)體：L-賴氨酸（L-Lysine）和 D-賴氨酸（D-Lysine）。聚賴氨酸（Poly-Lysine, PL）是一種常用于組織培養(yǎng)器皿表面涂層的合成蛋白聚合物，能夠支持貼壁細(xì)胞系的生長、附著和分化。PDL 由于帶正電荷且能抵抗某些細(xì)胞分泌的蛋白酶降解，因此相比 PLL 更受青睞（Wiatrak, 2020）。此外，PDL 作為人工合成蛋白，不會影響細(xì)胞的信號通路，因此廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板提供 96 孔和 384 孔兩種規(guī)格，其表面采用分子量在 70~150 kDa 之間的 PDL 聚合物進(jìn)行涂層處理，使微孔板表面形成均勻的正電荷。這種正電荷表面可增強(qiáng)與細(xì)胞膜負(fù)電荷之間的靜電相互作用（Curtis, 1983），從而提高細(xì)胞附著能力。

Sero Krystal™ PDL 微孔板特別適用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞系、原代神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。例如粘附性小鼠成纖維細(xì)胞系L929和其他常見粘附性細(xì)胞系，包括HEK-293、BHK-21、PC12和NSC-34.

L929 細(xì)胞系是一種來源于 C3H/An 雄性小鼠皮下疏松結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞株（Heap,  2021）。該細(xì)胞系常被研究人員用于病毒轉(zhuǎn)染及疫苗性能研究，并被視為細(xì)胞毒性測試的“金標(biāo)準(zhǔn)"（Dumitra?cu,  2022）。因此，本研究選用 L929成纖維細(xì)胞系進(jìn)行試驗。在選定的 PDL涂層或未涂層表面，使用無血清的  Dulbecco  改良 Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng) L929 細(xì)胞，并評估其形態(tài)、活性和生長情況。

實(shí)驗將組織培養(yǎng)處理（TC）未涂層96孔聚苯乙烯（PS）表面與 Sero Krystal™  PDL 涂層微孔板的實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行比較。同時，L929 細(xì)胞在這兩種表面上的形態(tài)及生長數(shù)據(jù)還與以未涂層 TC 表面并補(bǔ)充血清培養(yǎng)基為對照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

材料與方法

L929 細(xì)胞培養(yǎng)

冷凍的 AATC L929 細(xì)胞（Sigma, UK）解凍后，接種于 DMEM（Lonza,  Belgium）培養(yǎng)基中，并補(bǔ)充 2 mM 谷氨酰胺（Lonza,  UK）、1% 青霉素/鏈霉素（Sigma, UK）和 10% FBS（HyClone,  South America），于 37°C、5% CO? 環(huán)境下培養(yǎng)，每 48 小時傳代一次。

PDL板選擇

本研究使用了 Sero Krystal™ 透明 96 孔 PDL 涂層微孔板（Porvair Sciences, 英國，產(chǎn)品編號500269-PDL）。作為對照，選擇了 Sero™ Krystal™ 未涂層透明 96 孔組織培養(yǎng)（TC）處理板（Porvair Sciences, 英國，產(chǎn)品編號500269-TC）。

鋪板接種

在 75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)貼壁 L929細(xì)胞，使其在含有胎牛血清（FBS,  HyClone, 南美）、1%青霉素/鏈霉素（Sigma, 英國）和 2mM 谷氨酰胺（Lonza, 英國）的培養(yǎng)基中生長至匯合。然后使用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（Sigma, 英國）進(jìn)行消化。經(jīng)過37°C消化 5 分鐘后，細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫落，隨后加入10 ml含10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化。L929 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，以1,200 rpm離心 5分鐘收集細(xì)胞沉淀。棄去上清液，并加入10 ml無血清 DMEM培養(yǎng)基輕柔混勻，以形成單細(xì)胞懸液。使用臺盼藍(lán)（Biorad, 英國）染色法，并借助細(xì)胞計數(shù)載玻片及TC20全自動細(xì)胞計數(shù)儀（Biorad, 英國）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，遵循制造商說明操作。隨后，將50,000個細(xì)胞懸浮于100 µl 無血清 DMEM（Lonza, 比利時）中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺及 1%青霉素/鏈霉素（Sigma, 英國），并將其接種至所選微孔板的每個孔中。細(xì)胞在37°C、5% CO?的培養(yǎng)條件下孵育24小時。

形態(tài)學(xué)測試

在所選微孔板的含血清及無血清DMEM（Lonza，比利時）培養(yǎng)條件下孵育24小時后，使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察L929細(xì)胞，并使用ZOE熒光細(xì)胞成像儀（Biorad, 英國）拍攝圖像，以評估細(xì)胞的形態(tài)、生長和貼壁情況。每塊微孔板至少觀察10個孔，以確保所得圖像具有代表性。

細(xì)胞活力測試

在無血清培養(yǎng)基中孵育24小時后，從每塊微孔板隨機(jī)選取孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及活力測試。細(xì)胞活力測定采用臺盼藍(lán)染色法，并使用細(xì)胞計數(shù)載玻片及 TC20 全自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行檢測，具體操作與前述方法相同。在測定前，先去除選定孔中的培養(yǎng)基，并用100 µl預(yù)溫PBS（Lonza, 英國）清洗細(xì)胞。然后使用 50 µl  0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液（Sigma, 英國）消化細(xì)胞，并向每個孔中加入50 µl PBS（Lonza, 英國）使總體積達(dá)到 100 µl。通過輕柔吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，并從12個孔中記錄細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率，最終計算平均值。

結(jié)果與討論

為了驗證 Sero Krystal™ PDL 微孔板在無血清條件下促進(jìn)細(xì)胞粘附、增強(qiáng)增殖及提高存活率的性能，我們在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)處理（TC-treated）微孔板和 Sero Krystal™  PDL 涂層微孔板上培養(yǎng)了 L929 細(xì)胞。

如 圖 2A 所示，在無血清條件下生長的 L929 細(xì)胞在未經(jīng)涂層處理的 TC 處理塑料表面上表現(xiàn)出細(xì)胞聚集和較差的細(xì)胞粘附性。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，僅零星地附著在微孔板孔的表面，且細(xì)胞密度較低，形成了分化不良的細(xì)胞聚集體。相比之下，在Sero Krystal™ PDL 微孔板 上，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了完整融合，形態(tài)規(guī)則且分化良好。L929 細(xì)胞均勻分布在微孔板均勻涂層的孔表面（圖 2B）。在 Sero Krystal™ PDL 微孔板 上，無血清條件下 L929 細(xì)胞的融合度和粘附性與在 補(bǔ)充血清培養(yǎng)基 條件下 未涂層 TC 處理塑料表面 上的細(xì)胞生長情況相當(dāng)（圖 2C）。這意味著 Sero Krystal™ PDL 微孔板能夠避免動物血清相關(guān)的污染風(fēng)險、環(huán)境及倫理問題，同時降低成本，并消除批次間差異帶來的不確定性。

圖 2.  在無血清 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 L929 細(xì)胞生長情況：（A）TC 處理表面；（B）Porvair Sciences Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板；（C）補(bǔ)充 FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中 TC 處理表面。

細(xì)胞計數(shù)及存活率測定（見 表 1）表明，在 24 小時培養(yǎng)后，Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板上的 存活細(xì)胞數(shù)最高。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，在無血清條件下，Sero Krystal™ PDL 涂層表面為貼壁生長的 L929 細(xì)胞提供了 最佳的存活環(huán)境。在 Sero Krystal™  PDL 微孔板上培養(yǎng)的L929 細(xì)胞，其存活率提高了 約 50%。

表 1. 未涂層 TC 處理微孔板與 Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板的細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞活力讀數(shù)。

結(jié)論

本應(yīng)用說明突出了光學(xué)透明 96 孔 Sero Krystal™ PDL 微孔板在無血清或低血清條件下的性能。貼壁細(xì)胞系 L929 在該微孔板上表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞附著性、均一的細(xì)胞形態(tài)以及加速的生長和增殖。結(jié)果表明，Sero Krystal™ PDL 涂層微孔板系列是無動物成分的理想替代方案，可在無血清環(huán)境下實(shí)現(xiàn)安全、高效的貼壁細(xì)胞粘附。

Sero Krystal™ PDL 微孔板提供多種孔板格式，適用于高通量篩選，同時具備不同的框架顏色，以適配各類檢測系統(tǒng)，并通過最小化串?dāng)_提升光度檢測結(jié)果。

參考

1. Curtis, A.,  Forrester, J., McInnes, C. and Lawrie, F.,  1983. Adhesionof cells to polystyrene surfaces. Journal of Cell Biology, 97(5), pp.1500-1506.

2. Dumitra?cu, A.,  Cara?,  I.,  ?ucureanu,  C., Ermeneanu,  A.  and  Tofan, V.,  2022.  Nickel  (II)  and  Cobalt  (II)  Alginate Biopolymers as a “Carryand Release" Platform for Polyhistidine-Tagged Proteins. Gels, 8(2), p.66.

3. Heap, R., Marín-Rubio,J.,Peltier, J., Heunis,T., Dannoura, A., Moore, A. and Trost, M., 2021. Proteomics characterisation of the L929 cell supernatant andits role in BMDM differentiation. Life Science Alliance, 4(6), p.e202000957.

4. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak,

A., Piwowar, A. and Barg, E., 2020. PC12 Cell Line: Cell Types, Coating of Culture Vessels, Differentiation and Other Culture Conditions. Cells, 9(4), p.958.